什么是单细胞测序
顾名思义，单细胞测序（Single-cell Sequencing）就是在单个细胞水平上的测序。
为什么要进行单细胞测序
传统的测序使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能反应细胞群中的平均水平，没有考虑样本中各个细胞的异质性。单细胞测序技术的出现，使得从混杂的样品中筛选出异质性信息的难题得以解决。
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单细胞测序的方法
单细胞测序的方法概括起来就是两步：第一步，分离单细胞。第二步，对每个细胞进行测序。如果用最笨的办法，就是先一个一个的把细胞挑出来，再一个细胞一个细胞去测序。当然，我们不需要如此耗费时力，现在已经有了很多高通量的单细胞平台，其中 10x Genomics 平台占绝对统治地位。下面就以 10x Genomics 的单细胞 3' 转录组测序为例来介绍其方法。
一、工作流程概览
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二、凝胶珠的结构
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凝胶珠上连接的寡核苷酸链由 4 个部分组成：
1. TruSeq Read 1，cDNA 扩增与 Illumina 测序的引物结合区。
2. 16 个碱基的 Barcode，每个凝胶珠上的 Barcode 都不相同，用于区分不同的单细胞。
3. 12 个碱基的 UMI（Unique Molecular Identifier，唯一分子标记），用于 mRNA 计数。
4. 30 个碱基的 poly（dT），用来捕获 mRNA 并作为逆转录的引物。
三、单细胞液滴的形成
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凝胶珠（水相）从左向右流动，在第一个十字路口与细胞悬浮液（水相）相遇，凝胶珠与细胞混合在一起，流经第二个十字路口时，被油相分割，形成油包水的乳浊液。通过控制细胞悬浮液的稀释程度，可使大多数液滴（droplet，10x Genomics 把这些液滴称作 GEMs）中只包含一个凝胶珠和至多一个细胞。这一过程只需 7 分钟便可完成，每个样本一次可得到 500-20000 个单细胞。操作过程如下：
1. 加样
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2. 上机
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3. 回收 GEMs
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四、cDNA 的合成 GEMs 形成后，凝胶珠溶解释放出上面连接的寡核苷酸链，细胞裂解释放出 mRNA，逆转录酶与 dNTP 等已经提前混进细胞悬浮液中，在乳浊液的形成过程中，被包裹进 GEMs 里。只需把上一步回收的 GEMs 转入八联管，放入 PCR 仪中，就可以进行逆转录了。
寡核苷酸链上的 poly（dT）与 mRNA 的 polyA 互补配对，在逆转录酶的催化下合成 cDNA 第一链。逆转录酶采用 M-MLV RT（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶)，该酶会在合成链的 3' 端加上几个 C 碱基。
为了后续 cDNA 扩增，引入了一段 TSO（Template Switching Oligo，模板转换寡核苷酸）序列，此序列也已经在 Master Mix 中提前加入。TSO 3' 端的 rGrGrG 会与 cDNA 5' 端的 CCC 配对，并作为模板，使 cDNA 继续延伸。之所以用 rGrGrG，而不用 GGG，是因为 RNA-DNA 杂交具有更高的热稳定性。这一过程称为模板转换。
以上反应都在 GEMs 内部完成，合成的 cDNA 是全长的转录本。
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五、cDNA 扩增与建库 所有的 cDNA 分子都加上了代表细胞来源的 Barcode 以及代表分子来源的 UMI，并且两端都加上了相同的引物结合位点，这时，就可以把全部的 cDNA 分子从乳浊液当中分离出来，进行统一的 PCR 扩增了。扩增后，制成 Illumina 的测序文库，就可以放到 Illumina 的测序仪上进行测序了。
Pooled cDNA Amplification
Amplified cDNA Processing (dual index)
六、测序数据处理
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将 cDNA 测序数据与参考基因组进行比对，结果按细胞分组。然后对每个细胞中的每个基因进行 UMI 去重计数，生成表达矩阵。10x Genomics 的官方软件 Cell Ranger 提供了专门的 pipeline，用来完成这一过程。有了表达矩阵，就可以对数据进行进一步分析了。参考文献
【1】10X Genomics 官方文档：CG000731
【2】Macosko EZ et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 2015. doi: 10.1016/j.cell.2015.05.002.
【3】Zheng GX et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 2017. doi: 10.1038/ncomms14049.
【4】Zhang XN et al. Comparative Analysis of Droplet-Based Ultra-High-Throughput Single-Cell RNA-Seq Systems. Mol Cell. 2019. doi: 10.1016/j.molcel.2018.10.020.
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