肝纤维化一般由多种损伤因素造成慢性肝损伤引起,主要包括病毒感染、血吸虫病、酒精中毒等。肝纤维化形成的中心环节是肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)被激活为肌成纤维细胞,后者会合成和分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。ECM过量积累,肝脏结构遭到破坏,肝脏内纤维结缔组织异常增殖,最终逐渐演变为肝硬化甚至肝癌。HSC被激活继而形成肝纤维化的病理过程均受到基因调控,可以利用表观遗传机制对疾病进行有效控制。已有的资料表明,表观遗传在肝纤维化患者的早期诊断和治疗过程中有着举足轻重的意义。在各种表观遗传治疗机制中,基于DNA甲基化对肝内细胞增殖活化、脂质代谢以及肝脏疾病整个发展进程进行调控的治疗方式被广泛研究。

在肝纤维化过程中,各种促纤维化因子如血管紧张素Ⅱ、血小板衍生生长因子、转化生长因子-β(TGF-β)等可与HSC相互结合,并激活纤维化过程中的信号通路,HSC会进一步的活化、增殖,ECM在体内过量积累,导致肝纤维化形成。相关研究发现,甲基转移酶DNMT3A会催化TGF-β1诱导的HSC活化,敲低DNMT3A对HSC增殖有抑制作用。此外,使用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-Aza),可以特异性地抑制DNMT3A的催化亚基,减轻肝纤维化。由此可见,人体内各种纤维化因子的甲基化状态,不但能成为衡量肝纤维化的标志物,而且涉及肝纤维化进程,所以对其进行系统的研究,对肝纤维化疾病的诊断和治疗有重要意义(图1)。

同源性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)、O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶、Ras相关区域家族1A(RASSF1A)、谷胱甘肽S转移酶3、Septin 9(SEPT9)、TGF-β等易发生超甲基化。

PTEN作为磷酸酶基因,使用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)产生的中间产物作为其生理底物,并对脂质磷酸酶活性作用进行调控。这个过程的主要信号通路是PI3K/蛋白激酶B(AKT)和细胞外调节蛋白激酶(ERK),但此通道激活会导致HSC活化。不仅如此,在该过程中涉及的重要中介物TGF-β也会使HSC转变为肌成纤维细胞,提高α-SMA及胶原蛋白的表达。Bian等采用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza处理TGF-β诱导的HSC,发现PTEN在肝细胞中持续表达,能够抑制HSC活化从而减轻肝纤维化,如果PTEN高甲基化导致其功能丧失,就有可能引起PI3K的积累,继而增强信号通路AKT和ERK活性。这些结果均提示PTEN是治疗肝纤维化的重要靶点,基于甲基化上调PTEN的表达是潜在的治疗机制。

Ras三磷酸鸟苷酶激活样蛋白-1(RASAL1)在结直肠癌、肝癌等多种疾病中表达下调,被认为是具有潜力的抑癌基因。下调原因可能是其启动子高度甲基化导致RASAL1基因的沉默,继而引起RASAL1活性下降。有研究证明,Ras信号通路在肝纤维化中也发挥重要作用,如Tao等研究结果显示,RASAL1基因在肝纤维化中高甲基化,活化HSC并导致肝纤维化的产生。能够抑制RASAL1甲基化水平,最终控制肝纤维化的发展,是我们后续需要考虑并解决的问题。

SEPT9作为Septin蛋白家族的成员之一,参与细胞分化转移、细胞周期调控及细胞凋亡等多个过程。SEPT9还可降低TGF-β分泌,使Ⅰ型胶原蛋白的表达相应减少,由此证明SEPT9 表达水平的高低与肝纤维化发生和发展有一定关联。同时Wu等研究证明,HSC中的SEPT9在体内、体外发生超甲基化,所以之后对肝纤维的治疗过程中,可以此为靶点,增加SEPT9在体内外的表达,最终降低TGF-β的分泌而缓解肝纤维化。

分泌型焦磷酸蛋白1(Spp1)是一种分泌型酸类糖蛋白,它可由多种细胞(如成纤维细胞、炎症细胞、心肌细胞)产生。Spp1与CD44结合会激活PI3K/AKT通路,此信号通路同时也会增加Spp1的表达。研究结果表明,Spp1是PI3K/AKT通路的下游效应因子,并被PTEN所拮抗。

在实验小鼠Spp1基因被敲除的实验中发现,Spp1在肝损伤和纤维化的进展中起重要作用。Komatsu等利用甲基化高通量测序和新的信息处理技术分析表明,在四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化小鼠模型中Spp1表达增加,分析原因是由于Spp1出现低甲基化。低甲基化的Spp1 会打开PI3K/AKT通路,进而引起TGF-β释放,同时Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA释放也增多,导致肝纤维化甚至肝癌的发生。上述实验结论表明, Spp1低甲基化且表达增加,会导致甚至加剧肝纤维化。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在肝纤维过程中很少发生甲基化,但容易出现表观沉默。甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)作为一种结合蛋白参与HSC细胞的活化和转移过程,它在肝纤维化中过度表达,特异性结合甲基化DNA,抑制靶基因的转录。在这个过程中,PPARγ可通过沉默MeCP2表达,在一定程度上抑制肝纤维化。

催化甲基转移的DNMT分为DNMT1、DNMT2和DNMT3a/3b。其中DNMT1 是一种维持性甲基化酶,也是DNA复制甲基化模式的主要酶。DNMT1蛋白升高与存活率显著降低有关,因此,DNMT1蛋白表达增加可能会加剧肝纤维化的恶性进展。反之,5-Aza可以抑制DNA甲基化,调控一些高甲基化基因,对肝纤维化治疗有着重要作用。

最近的研究表明,DNMT1促进了H19启动子甲基化,而H19的异常甲基化会导致H19的异常表达,这与包括肝纤维化中在内的多种疾病有关。为了控制肝纤维进一步的恶化,Yang等在活化的HSC和CCl4诱导的大鼠肝纤维化组织中测定DNMT1和H19,结果表明正是DNMT1的过度表达抑制HSC中H19的作用,敲除DNMT1能够提高活化HSC中H19的表达。实验还证明用5-Aza处理活化的HSC模型后,可降低纤维化基因和DNMT1的表达,增强H19的表达,并减弱HSC的活化。

5-Aza是常用的DNA甲基化抑制剂,但由于它的低口服生物利用度和高细胞毒性作用,新的核苷类似物不断被开发,包括泽布拉林、地西他滨和6-硫鸟嘌呤。其中第二代DNA甲基转移酶抑制剂泽布拉林,由于其水溶性、稳定性、低毒性和高口服生物利用度的优点而被广泛应用。对泽布拉林的机制研究发现,其能够掺入DNA中并与DNMT形成共价复合物,以竞争性抑制DNMT活性,使肿瘤抑制基因去甲基化,并抑制肿瘤细胞增殖、分化和转移。另有研究显示,在纤维化的治疗中,泽布拉林可以抑制TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞分化为肌成纤维细胞,从而减少纤维化的发生。此外,泽布拉林以时间和剂量依赖性方式下调MeCP2表达并逆转TGF-β2诱导的α-SMA表达,表明泽布拉林能够抑制肝纤维化的发生。上述研究表明,成纤维细胞的纤维化特性与DNA甲基化高度相关,泽布拉林可以通过去甲基化抑制成纤维细胞的增殖。

总之，DNA甲基化读取蛋白DNMT1会促进HSC活化和肝纤维化,如由它介导的PTEN高甲基化,继而引起PTEN表达的降低,最终会导致肝纤维化的发生。所以,以DNMT1为靶点设计药物,抑制肝纤维化是可行的,新的核苷类似物泽布拉林就是很好的例子。目前实验也证明,番泻苷A通过靶向结合DNMT1,可以抑制DNMT1所介导的PTEN高甲基化,从而上调PTEN的表达,抑制AKT和ERK信号通路的激活,最终抑制肝纤维化。