基因测序技术是一种用于确定DNA序列的方法，从一开始的Sanger法测序，到后来的NGS，再到现在的单分子测序技术。
测序技术的发展推动了基因组学、生物医学研究和临床诊断的进展。
以下，我们通过3期文章，为大家介绍测序技术的来龙去脉，包括：
测序技术的发展史
Sanger测序原理和应用
NGS测序原理和应用
单分子测序原理和应用
测序技术的应用
文库构建和基因准备
1 什么是基因测序技术？
基因测序技术，即测定核酸序列的技术。
基因测序能够分析测定基因组全序列，锁定个人病变基因，预测患多种疾病的可能性，提前预防和治疗。
基因测序技术是人类探索生命奥秘的重要手段之一，最早的时候，基因测序只是应用于科研，是遗传学及分子生物学一个重要的科研工具。
但随着测序技术的发展，通过测序技术对遗传信息的解码和基因组数据库的构建，人类不仅得以窥探生命的密码，更能从基因层面对人类疾病进行检测甚至干预。
相信在基因测序技术指导下的遗传病诊治、个性化精准医疗等能够更加高效的进行，未来基因测序技术将对人类健康产生重大影响。
2 测序技术的发展历程
1977年，Sanger和Gilbert分别提出双脱氧链终止法和化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。
第一代测序具有长读长和准确率高的优点。但其同时也具有测序成本高、耗时久、通量低等缺点，导致其不能满足大规模基因测序的需求。
于是人们开始探究新的更高效的测序技术。
1996年，Ronaghi和Uhlen建立了焦磷酸测序，其与第一代测序技术最大的不同是边合成边测序。其最显著的特点是高通量和自动化，因而第二代测序又称高通量测序。
2005年，454Life Sciences公司基于焦磷酸测序原理推出了Genome Sequencer 20测序系统，成为二代测序的先行者。
2006年-2007年，Illumina公司和Life Technologies公司相继推出Solexa高通量测序系统和SOLiD高通量测序系统。
2009年，出现了以分子实时测序和纳米孔技术为代表的第三代测序。
第三代测序具有长读长、单分子测序的特点，但由于目前第三代测序技术因高错率仍未找到很好的解决方法，所以离临床实际应用还仍有相当长的距离。
2010年至今，各种高通量测序技术均已快速发展并逐渐成熟，随着生物科学、物理学、材料学等学科的不断发展和融合，未来的测序技术一定会向着更精准、更微观、更高通量、更廉价的方向前进。
3 Sanger双脱氧链终止法的基本原理
Sanger双脱氧链终止法是第一代测序技术中最为经典的一种。
其巧妙的利用DNA复制原理,利用ddNTP来部分代替常规的dNTP作为底物进行DNA合成反应。
在DNA合成时,一旦ddNTP参入到合成DNA链中,由于ddNTP脱氧核糖的3’-位碳原子上缺少羟基，而不能与下一位核苷酸的5’-位磷酸基之间形成3’,5’-磷酸二酯键，从而使得正在延伸的DNA链在此ddNTP处终止。
实验步骤：
1. 将待测序测序的DNA片段进行PCR扩增，得到充足的DNA模版用于进行测序。
得到的DNA模板需要进行纯化，需要确保去除所有杂质，包括DNA片段、蛋白质、RNA等。
2. 根据待测序列的特点与实验要求，设计一些特定的引物。
一般来说，通用引物的长度以15～30bp为宜。
3. 合成标记物。标记物是指示测序反应是否成功的物质，通常是一种荧光染料或放射性同位素。
4. 将DNA模板、引物、DNA聚合酶和标记物等物质混合在一起，进行测序反应。
在反应过程中，DNA聚合酶将根据DNA模板中的碱基序列合成新的DNA链，同时将标记物结合到新合成的DNA链中。
5. 将反应产物进行电泳分离，根据标记物的不同荧光信号或放射性同位素的存在，确定DNA序列中的碱基排列顺序。
在Sanger测序法的基础上，将荧光信号接收器和计算机信号分析系统替代放射自显影技术，使用荧光素标记替代32P或35S单一放射性核素标记，打开了DNA测序技术自动化的大门。
Sanger测序法的优缺点：
优点：
1.sanger是直接对DNA分子进行测序，适用于已知序列的验证测序、文库筛选、克隆鉴定、pcr重测序等。
2.其最大优点在于读取速度很高、高精确度，而且成本相对很低。相较于化学降解测序法，对于富含G-C的区域也不会影响测序效果。
缺点：
1.必须有已经序列设计测序引物，对于未知序列必须构建克隆后才能测序，难以实现基因组水平的大规模测序。
2.测定碱基序列需要大量完全相同的DNA拷贝。
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